酶聯(lián)免疫法基本原理及注意事項

　　這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA試劑盒中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因elisa試劑盒的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物(見3.6)。在用肉眼判斷結(jié)果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。ELISA試劑盒定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯**況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷。

　　OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。

　　TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后ELISA試劑盒，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，ELISA試劑盒至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基*(SDS)等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。

　?、偈箍乖蚩贵w結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

　?、谑箍乖蚩贵w與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

　　BUNSEN本生ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：

　?、俟滔嗟目乖蚩贵w

　　②酶標記的抗原或抗體

　?、勖缸饔玫牡孜?。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。

　　BUNSEN本酶聯(lián)免疫法注意事項：

　?、闭皆囼灂r，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　?、苍贓LISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：

　　⑴固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。

　?、瓢豢贵w(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值而蛋白量少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。

　?、敲笜擞浛贵w工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

　　⑷酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是當(dāng)前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

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